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食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定gbt4789.03-2003
1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的测定。
2 术语
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽
胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质
量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
3 引用标准
GB 478.28 食品卫生微生物学检验 染色法 培养基和试剂
4 设备和材料
4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱:0～4℃。
4.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。
4.4 天平。
4.5 显微镜。
4.6 均质器或乳钵。
4.7 平皿:直径为90mm。
4.8 试管。
4.9 吸管。
4.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
4.11 玻璃珠:直径约5mm。
4.12 载玻片。
4.13 酒精灯。
4.14 试管架。
5 培养基和试剂
5.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
5.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
5.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
5.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
5.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
5.6 生理盐水。
5.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
6 检验程序
大肠菌群检验程序如下:
┌─────┐
│ 检样 │
└──┬──┘
┌──┴──┐
│ 稀释 │
└──┬──┘
┌─────┴─────┐
│ 乳糖胆盐发酵管 │
│ 36 ±1℃ ,24±2h │
└─┬───────┬─┘
┌───┴─┐ ┌─┴───┐
│ 不产气 │ │ 产气 │
└──┬──┘ └─┬───┘
┌──┴───┐┌───┴───────┐
│大肠菌群阴性││ 伊红美蓝琼脂平板 │
└──┬───┘│ 36 ±1℃ ,18±24 │
┌──┴──┐ └──┬─────┬──┘
│ 报告 │┌───┴─┐ ┌─┴───────┐
└─┬───┘│革兰氏染色│ │ 乳糖发酵管 │
│ └──┬──┘ │36 ±1℃ ,24±2h │
│ │ └─┬──────┬┘
┌─┴───┐┌──┴───┐┌─┴───┐┌─┴───┐
│革兰氏阳性││革兰氏阴性 ││ 产气 ││ 不产气 │
└─┬───┘│无芽胞杆菌 │└┬────┘└─┬───┘
│ └────┬─┘ │ │
┌─┴────┐ ┌┴───┴─┐┌────┴─┐
│大肠菌群阴性│ │大肠菌群阳性││大肠菌群阴性│
└─┬────┘ └───┬──┘└────┬─┘
┌─┴───┐ ┌──┴──┐ ┌───┴─┐
│ 报 告 │ │ 报 告 │ │ 报 告 │
└─────┘ └─────┘ └─────┘
7 操作步骤
7.1 检样稀释
7.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌
玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的
均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10
的均匀稀释液。
7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液
的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
7.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1
支1mL灭菌吸管。
7.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释
度,接种3管。
7.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发
酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃
温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如
有产气者,则按下列程序进行。
7.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,
然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
7.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵
管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为
阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
7.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
8 粪大肠菌群(faecal coliform)
8.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转 种于EC肉汤管内,
置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养
后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉
汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证
实为粪大肠菌群阳性。
8.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群
的MPN值。
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
┌──────────────────┬─────┬─────┐
│ 阴性管数 │ MpN │95％可信限│
├─────┬─────┬──────┤100 mL(g) ├──┬──┤
│1mL(g)，*3│0.1mL(g)*3│0.0lmL(g)*3 │ │下限│上限│
├─────┼─────┼──────┼─────┼──┼──┤
│ 0 │ 0 │ 0 │ ＜30 │＜5│ │
│ 0 │ 0 │ 1 │ 30 │ │ │
│ 0 │ 0 │ 2 │ 30 │ │90 │
│ 0 │ 0 │ 3 │ 30 │ │ │
├─────┼─────┼──────┼─────┼──┼──┤
│ 0 │ 1 │ 0 │ 30 │＜5│ │
│ 0 │ 1 │ 1 │ 60 │ │130 │
│ 0 │ 1 │ 2 │ 90 │ │ │
│ 0 │ 1 │ 3 │ 120 │ │ │
└─────┴─────┴──────┴─────┴──┴──┘
续表
┌───────────────────┬────┬─────┐
│ 阳性管数 │ MPN │95％可信限│
├─────┬──────┬──────┤100mL(g)├──┬──┤
│1mL(g)×3 │0.l mL(g)x3 │0.0lmL(g)X3 │ │下限│上限│
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 0 │ 2 │ 0 │ 60 │ │ │
│ 0 │ 2 │ 1 │ 90 │ │ │
│ 0 │ 2 │ 2 │ 120 │ │ │
│ 0 │ 2 │ 3 │ 160 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 0 │ 3 │ 0 │ 90 │ │ │
│ 0 │ 3 │ 1 │ 130 │ │ │
│ 0 │ 3 │ 2 │ 160 │ │ │
│ 0 │ 3 │ 3 │ 190 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 0 │ 0 │ 40 │＜5 │200 │
│ 1 │ 0 │ 1 │ 70 │ 10 │210 │
│ 1 │ 0 │ 2 │ 110 │ │ │
│ 1 │ 0 │ 3 │ 150 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 1 │ 0 │ 70 │10 │230 │
│ 1 │ 1 │ 1 │ 110 │ 30 │360 │
│ 1 │ 1 │ 2 │ 150 │ │ │
│ 1 │ 1 │ 3 │ 190 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 2 │ 0 │ 110 │ 30 │360 │
│ 1 │ 2 │ 1 │ 150 │ │ │
│ 1 │ 2 │ 2 │ 200 │ │ │
│ 1 │ 2 │ 3 │ 240 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 3 │ 0 │ 160 │ │ │
│ 1 │ 3 │ 1 │ 200 │ │ │
│ 1 │ 3 │ 2 │ 240 │ │ │
│ 1 │ 3 │ 3 │ 290 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 2 │ 0 │ 0 │ 90 │10 │360│
│ 2 │ 0 │ 1 │ 140 │ 30 │370 │
│ 2 │ 0 │ 2 │ 200 │ │ │
│ 2 │ 0 │ 3 │ 260 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 2 │ 1 │ 0 │ 150 │ 30 │440│
│ 2 │ 1 │ 1 │ 200 │ 70 │890│
│ 2 │ 1 │ 2 │ 270 │ │ │
│ 2 │ 1 │ 3 │ 34o │ │ │
└─────┴──────┴──────┴────┴──┴──┘ 注:①本表采用3个稀释度〔1mL(g)/0.1mL(g)和0.01mL(g)〕,每稀释度3管。 ②表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)、和0.1mL(g)时,表内数字应相应降低10倍; 如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时,则表内数字应相应增加10倍。其
余可类推。
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附加说明:
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准主要起草人刘宏道。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
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中华人民共和国卫生部1994-03-18批准 1994-09-01实施
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